Rambler's Top100


logo














 

Калькулятор CO2

 

АКВАРИУМНАЯ ГИДРОХИМИЯ

Биотестирование в домашних условиях, часть II (методика биотеста)

Как дома поставить
настоящий биотест?
Биотестирование на моллюсках

    О том, как реагируют улитки ампулярии на токсичное загрязнение аквариумной воды уже написано. Но как количественно и достоверно оценить вредное действие этого загрязнения? Это можно сделать с помощью эксклюзивного метода биотестирования от Живой Воды.

    В этой статье я расскажу о методе биотестирования воды с помощью улиток ампулярий (Pomacea sp.), разработанно23м мною в соавторстве с Н.Е. Шуваловой (она также в настоящее время работает в Живом Уголке).
    В данном биотесте в качестве тест-функции (той функции, которая изменяется под токсическим действием загрязнителя; по степени отклонения этой функции от её средней величины в норме мы и будем судить о токсичности) использовано пищевое поведение моллюсков. Выбор не случаен. Поиск еды - это доминирующая форма поведения у ампулярий. Они готовы есть практически всегда. А из этого следует, что вам не придется долго уговаривать улитку сделать то, что вам надо. Поиск еды - сложная реакция, которая выполняется благодаря согласованной работе практически всех органов и систем организма. Она сильно зависит от токсичности окружающей среды, заметно замедляясь при ее возрастании. Это замедление является хорошим интегральным показателем негативного воздействия на организм. При очень высокой токсичности улитки перестают питаться и искать пищу. Наверное, вы и по себе знаете, когда очень плохо себя чувствуешь, то есть не хочется. Из этого следует, что диапазон токсичности, в котором работает данный биотест, хотя и достаточно широк, но все же ограничен. Если вода настолько ядовита, что улитки перестают питаться, то выбранная тест-функция перестает работать. В этом случае надо будет ориентироваться по дыхательной активности и смертности наших тест-организмов. Но для аквариумистов как раз наибольшую проблему и составляет определение относительно невысокой токсичности загрязненной аквариумной воды, которая вызывает хронические, а не острые отравления*. Здесь будет описана адаптированная к домашним условиям и несколько упрощенная версия биотеста.

Поисковое пищевое поведение Голодная ампулярия ищет еду. Обратите внимание на лоцирующие движения усов. Улитка пытается определить направление на источник запаха. Если ваши улитки чувствуют себя хорошо, именно так они должны себя вести, почуяв съестное

    Что надо иметь?
    Вам нужен хорошо запущенный аквариум, можно и небольшой, литров на 30-40, в котором жила бы популяция из 20-30 улиток ампулярий. В любительских целях можно иметь только полтора десятка улиток, для приближенной оценки токсичности хватит и этого. Желательно использовать улиток-родственников (из одной кладки) или хотя бы взятых из одного аквариумного хозяйства. Если их набирать "с миру по нитке" от разных хозяев, то их поведенческие реакции могут слишком сильно отличаться друг от друга. Улитки должны себя хорошо чувствовать. Судить об этом можно по тому, как быстро они находят и насколько умело и активно поедают корм. В норме улитки очень хорошо чуют еду, в частности НАШ КОРМ, крупную фракцию которого (гранулы) мы и рекомендуем использовать в качестве пищевой приманки. Учуяв корм, улитки начинают делать очень характерные лоцирующие движения усами, определяют направление и уверенно находят еду. При этом они ползают далеко высовываясь из раковины, их нога прекрасно прилипает к поверхности грунта и к стеклу. Улитки не покрыты беловатыми кусочками или плёночками слизи. Раковины улиток должны быть относительно целыми, допустимы лишь незначительные каверны. Предпочтительно использовать молодых ампулярий размером с вишенку или с небольшой грецкий орех.
    Если раздавить гранулу корма или насыпать на поверхность порошковую его фракцию (ту, что используется для выкармливания мальков), то улитки должны на это дружно отреагировать выползанием на поверхность воды и собиранием плавающего порошка с помощью "воронок". Окисляемость воды в таком аквариуме не должна быть выше 6, рН=6.5-8. Можно пользоваться улитками из общего аквариума с рыбами. Но в этом случае вероятны существенные искажения результатов биотестирования из-за того, что улитки привыкают ползать и искать корм с поджатыми усами, а это затрудняет поиск пищевой приманки. Кроме того, эти усы могут быть просто оторванными рыбами.

Защитно-оборонительная реакция

Если улитки находятся под постоянным прессингом рыб, то они привыкают ползать со свернутыми усами, отыскивая корм на ощупь с помощью губных щупалец. Стрелочкой на рисунке показан глаз улитки, ус огибает его снизу и уходит под раковину, непосредственно грунта касаются губы и губные щупальца. Ампулярия нахлобучила раковину на голову, чтобы максимально защититься. Очень вероятно, что и в экспериментальной ванночке для биотестирования улитка будет себя вести точно так же.
В этом случае она непригодна для биотеста

    Из оборудования надо иметь ванночку или фотокюветку длинной 15-20 см и шириной 10-12 см. Для крупных ампулярий потребуется посудина несколько больших размеров. Но в любом случае расстояние между улитками и пищевой приманкой не должно превышать 19 см (обычно оно составляет 11 - 15 см), иначе поиск приманки во время биотестирования сильно затянется. Глубина может быть очень небольшой, слой наливаемой в кювету воды составляет только 3-4 см. Сам опыт надо проводить в теплом помещении, при температуре воздуха в нем 24-28°С (оптимальная температура воды при биотестировании - 25°С), следите чтобы вода не остывала ниже 24°С. Ванночка должна быть установлена на устойчивом, не вибрирующем и не шатающемся, например от шагов проходящих мимо людей, столе, так как улиток пугает вибрация и сотрясения. Еще нужны часы, желательно с секундной стрелкой (точность замеров времени в пределах десятков секунд вполне устроит). Вот, собственно, и все.
    Теперь расскажу о процедуре биотестирования. Она состоит из подготовительного этапа и собственно биотеста.
    Подготовительный этап - самый трудоемкий, но впоследствии, при биотестировании отдельных проб, его не надо будет повторять вновь.
    На этом этапе мы должны получить статистические данные о времени поиска моллюсками стандартной пищевой приманки в стандартных условиях. Для этого из аквариума с улитками наугад выбираем 6 улиток. Располагаем их у одной из стенок ванночки, а в 3 см от противоположной стенки очень аккуратно (не напылив) помещаем гранулу корма. Лучше всего использовать НАШ КОРМ, но подойдет и простая геркулесинка. В обоих случаях приманку можно прикрепить к небольшому кусочку детского пластилина чтобы она не всплывала и расположить на дне в нужном месте. Важно, чтобы это всегда было одно и тоже место - нацарапайте там крестик. Порядок действий таков: сначала ко дну ванночки, вблизи одной из торцевых стенок, клеим приманку, потом аккуратно, с противоположного конца, заливаем аквариумную воду. Эта вода из того аквариума, где живут улитки. Её можно осторожно (не поднимая мути) начерпать хоть чашкой (но только очень чистой - без следов сахара и кофе!). Надо внимательно смотреть чтобы не попадались растения и отдельные листики. Есть и другой вариант. Заливать кипяченую, остуженную и хорошо проаэрированную водопроводную воду. Этот вариант годится, если между аквариумной и кипяченой водой не будет перепада рН более чем в 1 единицу. Затем ловим улиток - сразу всех шестерых и располагаем их в ванночке в линию вблизи стенки, противоположной той, где размещена приманка. Улиток не кормим сутки до опыта. Засекаем время. Улитки начинают почти сразу вылезать из раковин, скорее всего они провентилируют легкие и начнут искать корм. Обычно первая оказывается у приманки спустя 1.5-2.5 минуты (время может у вас быть другим), тут же аккуратно чистыми пальцами (без следов корма!), а еще лучше пинцетом, выньте улитку и посадите, например, в чашку с водой. Время поиска, показанное первой улиткой, не учитывайте. Тут к приманке начнут подтягиваться остальные участники улиточных гонок. Теперь надо смотреть во все глаза! Вы должны засечь время (точность хотя бы в плюс-минус 10 сек), когда улитка губами коснется приманки и сразу же отправить ее в чашку к первой. Вот так определяется время поиска пищевой приманки четырьмя улитками. Последнюю можно не дожидаться – ее время в зачет не идет.
    Зачем нужна именно такая процедура? Все очень просто - отбрасывание первого и последнего результата страхует от случайностей. В относительно небольшой ванночке корм можно найти, если просто случайно поползти в нужном направлении никуда не отворачивая. Вот такой сверхбыстрый результат мы и не будем учитывать. Шестой результат тоже не слишком важен. Конечно же, в норме улитки только тем и заняты, что еду ищут. Но все же одна из 6 может временно, исходя из каких-то своих соображений, и не захотеть этого делать. Вот ее время мы и отбросим. Теперь посмотрим на картинки, наглядно показывающие как шестерка улиток ищет пищевую приманку.

биотестирование Исходно я расположил улиток у самой стенки ванночки, но они столь быстро стартовали, что отснять их там я просто не успел. Фото сделано секунд через 20 после размещения всех улиток. Хорошо чувствующие себя улитки ползают быстро. И в самом деле, это похоже на бега. Приз указан стрелочкой
биотестирование на улитках Прошла минута. В гонке определились лидеры. Другие улитки задержались на старте, одна еще только вылезает из раковины. А одна решила, что ей никуда не надо: села на бортик и проверяет не удастся ли чего отловить с помощью воронки?
использование поведенческих реакций в биотестировании Даже в норме движение улиток не слишком прямолинейно. Прямо на цель идет только одна
сложные тест-функции в биотестировании Другая улитка явно промахнулась (она потом исправит ошибку), но вот одна прямиком доползла до приманки. Добыча схвачена! Это и есть тот миг, когда надо зафиксировать время поиска (2 мин.)

Поиск и захват пищевой приманки

биотестирование пресных вод Вам надо будет сразу же после контакта убрать улитку, чтобы она не наелась. Но в данном опыте я для наглядности оставлял улиток у приманки. Так легче представить, что происходит
биотест Еще один участник гонки достиг цели. Вот его время: 2 мин. 40 сек., или 2.7 мин. Оно пойдет в зачет для данной команды, а первый результат мы отбросим - вдруг он случайный?
биотест на брюхоногих моллюсках Промахнувшаяся улитка без пользы для себя обшарила углы кюветы, а тем временем задержавшиеся на старте участники уверенно пошли к цели
биотест на улитках Но и та, что промахнулась теперь разобралась в ситуации. Когда у приманки скапливается много улиток, они мешают друг другу и поэтому в реальном опыте их надо своевременно убирать
пищевое поведение Ну вот, теперь почти все достигли цели ( время поиска 2.7; 3.3; 4 мин.), только одна никуда не спешит. Ну не всем же вести себя на все 100% одинаково? Поэтому последнюю улитку мы ждать не будем и последний результат не фиксируем вообще. Обратите внимание, улитки не расползаются. Это лишний раз говорит о том, что они целенаправленно искали еду
биотест на брюхоногих моллюсках Улитки толкаются у приманки. Тут мы и предпоследнюю улитку дождались (4.5 мин). Только что улитки продемонстрировали поисковое пищевое поведение. Искать еду - вот основное дело жизни улиток. Только одна из 6-ти временно может этим не заниматься

ампулярии

    Далее, если в вашем распоряжении есть еще одна или несколько шестерок улиток, то набирайте очередную и делайте тоже самое. Ванночку перед новым стартом следует ополоснуть и использовать новую приманку и новую воду. Иначе улитки будут ходить по старым следам. Если у вас осталось еще только шесть-семь улиток, то выпускайте в аквариум тех, что уже участвовали в гонках (они не должны были успеть утолить голод) и спустя 15 минут наугад выбирайте новую шестерку участников. Повторите все вновь. Вот от этого подготовительного этапа потом будет зависеть статистическая достоверность результатов проводимых вами биотестов. Делайте все одинаково! Этот этап самый трудоемкий. Практика показывает, что надо получить данные хотя бы о 15 выборках. А если работать по науке, то надо провести более 30 улиточных гонок**, но будем реалистами... Как, я уже говорил, здесь описывается упрощенная методика, которую в часы досуга посильно выполнить дома. Но чувствительность и надежность этого метода все равно высока! Если в один день не удается провести 15 предварительных заездов, то по прежнему не кормите улиток и не давайте им наедаться в опытах первого дня, продолжайте гонки на другой день. Вообще-то если улитки здоровы и вода в том аквариуме, где они живут хорошая, то к приманке они бегают быстро и показывают кучные результаты. Пятнадцать забегов провести не так и долго. Можно это делать в компании с друзьями и если улитки разноцветные и разного размера (т.е. различимы) делать ставки, кто в каком порядке придет (только следите, чтобы болельщики не трясли стол).
    Завершается подготовительный период обработкой результатов:
    Для каждого "заезда" находим среднее время поиска пищевой приманки четырьмя улитками (первый и последний результаты откидываем). Мы только что "прогнали" одну группу с результатами: 2,0; 2.7; 3.3; 4.0; 4.5; - мин. Красным обозначено отбрасываемое лучшее время, последняя улитка не дошла до цели ( - ). Воcпользуемся таблицей Exel:

Биотестестирование, статистичекая обработка
Можно скачать вот такой "экселевский" файл, в который уже "вмонтированы" все необходимые формулы, и надо будет только вставлять полученные вами данные: в зеленое поле - результаты предварительных испытаний и в желтое - данные тестирования, и он сам все посчитает. Если вы хотите узнать в подробностях, в чем суть статистической обработки результатов, примененной в данном методе биотестирования, то кликнете ЗДЕСЬ! А о том, какие выводы можно сделать ни во что особо не вникая, а просто получив "значение функции нормализации", рассказано ниже

    Сначала в зеленое поле по столбцам внесем результаты предварительных заездов. На картинке результаты той шестерки, бега которой отражены на фотографиях, размещены в первом столбике (выделены более светлым шрифтом). Далее - результаты других шестерок. Вам придется получить свои данные, характеризующие именно вашу популяцию (совокупность) улиток и заменить ими те, что показаны на рисунке. Ниже красным выделено среднее время поиска приманки улитками в отдельных группах - всего 15 значений, а еще ниже среднее этих средних. Невероятно, но факт: оно всегда в точности будет равно среднему значению времени поиска приманки для всех 60 полученных результатов.
    У вас конечно же получатся другие цифры, но эти послужат ориентиром. Если среднее время поиска у вас составит 10 минут и более (у меня - 3.8 мин.), то стоит призадуматься: все ли в порядке с условиями содержания ваших улиток. Опять же, если оно окажется меньше чем 2 мин, стоит поискать допинг (который суть тоже яд!), дабы выяснить, что это улитки носятся как ненормальные?
    Вернемся к картинке. Ниже и тоже красным показано значение стандартного отклонения для этих средних. Среднее значение времени поиска пищевой приманки и стандартное отклонение выборочных средних - это и есть параметры поведения исследованной нами совокупности улиток в норме. Эти величины с помощью функции "нормализация" будут использоваться для интерпретации результатов биотестирования. Еще ниже в желтом поле внесены результаты, показанные шестеркой улиток при тестировании некой пробы воды (откуда эта вода и что планировалось узнать при ее тестировании будет рассказано чуть погодя). Величина 5.5 под значком "Х" - это среднее значение этих результатов, величина 2.3 - это значение функции "нормализация" от 5.5. Известно, что если величина функции нормализации какого-либо значения больше чем 1.96, то только с вероятностью менее 5% это значение может принадлежать к той совокупности, с параметрами которой это значение сравнивали (нормализовали). Если же нормализация равна 3, то вероятность принадлежности к этой совокупности уменьшается до 0.27%. Если объяснить простым человеческим языком, какие выводы из этого можно сделать применительно к нашим экспериментам, то получится следующее. Вы сделали биотест (тут мы стали уже рассматривать второй этап биотестирования), внесли данные о времени четырех улиток в желтое поле и компьютер тут же выдал значение функции нормализации, которое оказалось, например, равным 3. Для биотеста вы выбирали шестерку улиток наугад. Так вот, вероятность случайно выбрать такую шестерку, чтобы она в стандартных условиях показала такой результат составляет менее трех шансов из тысячи. Таких событий в реальной жизни почти никогда не случается. Мы имеем все основания полагать, что и у нас произошло что-то иное. Но, что? И почему среднее время поиска так сильно отличается от средней величины, характеризующей пищевое поведение ваших улиток? Вы делали опыт в стандартных условиях. Вот только вода была другая - не стандартная, а та, что вы хотели протестировать. Стало быть все дело в воде. Это она так подействовала на улиток, что они стали медленнее искать корм. Теперь считать их принадлежащими к совокупности нормальных улиток, параметры поведения которых мы определили в предварительных опытах, можно только с вероятностью 0.0027. Но с вероятностью 0.9973 мы можем считать их принадлежащими к совокупности улиток отравленных. (Поясним, что вероятность события, которое произойдёт обязательно, принято приравнивать к единице, или к 100%). Таким образом вы выявили токсичность воды, то есть сделали биотест! Все не так уж и сложно, правда?
    Итак, у нас есть аквариум, где припеваючи живут улитки ампулярии. Они охотно бегают к пищевой приманке. Если вы наугад возьмёте 6 улиток и заставите их искать корм в стандартной ванночке в стандартных условиях, то полученный результат, как правило, при нормализации не даст величины превосходящей значения 1.96 (вероятность получить такое - только пять шансов из ста, а это не много). Если вдруг при тестировании воды улитки дают этот результат, то вероятность того, что он случаен (вода не оказывает токсического действия, но вот такая медленная шестерка ненароком подобралась) - только 5%. Соответственно, с вероятностью 95% можно говорить о влиянии воды на поведение улиток. В биологии подобные результаты считаются статистически достоверными. И мы будем считать, что тестируемая вода обладает токсическим действием, если при нормализации среднего времени поиска приманки получим результат 1.96 и более. Если вас все же одолевают сомнения в достоверности результата, то повторите биотестирование на другой шестерке улиток. Если и они покажут то же самое, то сомневаться больше не надо. Два раза подряд наблюдать событие, вероятность которого менее 5% практически невероятно и, значит, испытуемая проба наверняка оказывает токсическое действие.
    Теперь, можно переходить к решению насущных задач. Допустим, вы хотите протестировать воду из нового аквариума, где рыбы чувствуют себя не очень хорошо. Вам, собственно, надо узнать больны ли рыбы чем-то, или просто вода их потихоньку травит. В практическом плане это важно, ведь надо решить: либо рыб лечить, либо гидрохимические параметры воды исправлять? Тут очень важно не ошибиться, ведь лечение рыб обычно эти самые параметры еще более ухудшает.
    Наберите из подозрительного аквариума литр воды. Измерьте температуру и в случае необходимости нагрейте воду до 27°С (во время гонок в кювете вода обычно потихоньку остывает, нам надо чтобы она не успела остыть ниже 25° С). В литровую банку с испытуемой водой посадите наугад выбранную шестерку улиток на 2 часа. Если вода токсична, то как правило, через это время она успевает оказать заметное влияние на состояние улиток. Через 2 часа "зарядите" кюветку приманкой, залейте водой из банки с улитками и поместите улиток в стартовую зону. Время пошло!
    Улитки поползли к приманке. Но, выяснилось, что они часто отвлекались от поиска, так как поднимались к поверхности воды, чтобы подышать. Кроме того, они потеряли много времени устраивая воронки. В итоге, среднее время поиска увеличилось до 5.5 мин. (как раз этот случай и отражен на картинке). Нормализация этого значения дает величину 2.3. Вы уже знаете, что получить такой результат случайно (то есть без особых причин, просто так) мало вероятно. Отсюда вывод: вода повлияла на улиток и они искали корм хуже обычного. Вода токсична. В ходе опыта вы видели, что улитки часто "дышали" и увлекались "воронками", что, собственно, и увеличило время поиска. О чем могут говорить отмеченные поведенческие реакции улиток написано здесь.
    Еще пример. Для нового аквариума вы купили новый красивый фон, который устанавливается внутрь аквариума вдоль задней стенки. Вас насторожил довольно интенсивный запах от этого изделия и закрались подозрения... Залейте в аквариум воду (можно и не много) и утопите фон, либо хотя бы часть его. Подождите дня три, а потом протестируйте эту воду. Действуем также как всегда: сажаем 6 улиток на 2 часа. Потом устраиваем гонки. Что видим? Улитки возбужденно ползают по кюветке. Воронок не делают, но "дышат" немного чаще обычного. Но важно не это. Они, похоже, не могут быстро найти приманку! Вроде бы сначала начинают ползти в нужном направлении, но потом вдруг тормозят и начинают грызть дно кюветки не доходя до еды. Потом опять ползут, но могут даже несколько раз промахнуться и проползти мимо приманки, и только потом ее находят (время поиска отмечается, только тогда, когда моллюск губами касается еды). В итоге, среднее время поиска оказалось большим, чем обычно. Его нормализация дала значение 1.96. Есть все основания подозревать, что фон токсичный. А вдруг все же нет? Просто улитки за два часа не успели привыкнуть к необычному, но не опасному в принципе запаху? Этот запах помешал поиску, но еду-то они в конечном итоге нашли. Возможно, что со временем запах уйдет, а рыбки и улитки перетерпят это неприятное время без вреда для себя. Вот это тоже можно проверить с помощью нашего метода биотестирования и об этом будет написано в продолжении.
    Если вы дочитали до этого места, то возможно осилите и следующую статью. Конечно же, это не развлекательное чтение, но сомнения в безвредности силикона которым склеен аквариум, пластмассы, из которой сделано аквариумное оборудование и декорации, коряг, торфа и прочих наполнителей для фильтров терзали, терзают и будут еще терзать очень многих аквариумистов. Я описываю реально действующий и надежный, пусть и достаточно трудоемкий, способ проверки.

В. Ковалёв, кандидат биологических наук.

*Для определения веществ, которые обычны в аквариумной воде и при значительном превышении своих предельно допустимых концентраций вызывают острые отравления у жильцов вашего аквариума разработаны и продаются в зоомагазинах специальные тесты для аквариумистов. Об этих опасных веществах и использовании тестов можно почитать в следующих статьях:

СОСТАВ АКВАРИУМНОЙ ВОДЫ: ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ.

Пять очень важных параметров качества воды и как ими пользоваться не запутавшись.

В аквариуме что-то не так??? Попробуем разобраться!

В стиле ОЧ.УМЕЛЫХ II.

Кислотный дождь.

Вернуться к тексту

**В свое время нам пришлось провести более 100 предварительных заездов, чтобы получать статистически достоверные результаты. Тогда у нас не было компьютера и пришлось большой массив данных обсчитывать вручную, и не один раз, так как сначала надо было подобрать оптимальный вариант статистической обработки. Да, наука требует жертв!
Вернуться к тексту


Наверх   На Главную страницу

Rambler's Top100      Рейтинг@Mail.ru     

Аквариум. Современная Аквариумистика.
Правообладатель: Живая Вода®   Любые способы полного или частичного копирования и публикации данного текста и иллюстраций без письменного разрешения администрации интернет-ресурса vitawater.ru запрещены.

   © Живая Вода, 2001-2016 гг.   @webmaster

Реклама