Rambler's Top100


logo














 

 

Трансгенные рыбы желанные - питомцы в наших аквариумах

трансгенные рыбы
трансгенные рыбки - медаки

Рыбки и РЫБИНЫ

трансгенные рыбы - лососи

    В 90-х годах прошлого века Zhiyuan Gong, трудился в Канаде над своей докторской диссертацией. Там он начал опыты, в которых в икринки рыб вводилась полученная из России жидкость, содержащая гены морского анемона*. Так начались работы, которые в конце концов привели к созданию светящихся аквариумных рыбок.

 Zhiyuan Gong

Профессор Сингапурского Национального Университета (National University of Singapore) Dr. Zhiyuan Gong – один из первых создателей флуоресцирующих генетически модифицированных аквариумных рыб. Данио рерио, светящиеся красным, зеленым и желтым светом – его детище.

Практически одновременно с генетически модифицированными данио появились и светящиеся рисовые рыбки – медаки. Сначала зеленые, а потом и других расцветок. Их создал в 2001 г. другой профессор – H.J.Tsai из Тайваньского Национального Университетаt (National Taiwan University)

    Однако в то время о сотворении столь необычных домашних любимцев никто не думал. Исследования преследовали сугубо научно-практические цели и велись в основном на лососевых рыбах. Отрабатывалась техника пересадки в геном рыб чужого гена (трансгена) и выяснялось как сделать его конструкцию такой, чтобы организм нового хозяина начал активно синтезировать чужеродный белок, структура которого закодирована в "подсаженном" гене. Эти исследования можно было бы заметно ускорить, если пересаживать ген, кодирующий нетоксичный и легко обнаруживаемый белок, синтез которого возможен уже на самых ранних стадиях эмбрионального развития трансгенного организма. И такие гены действительно были выделены сначала из медузы (Aequorea victoria ) – ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, или GFP), и несколько позднее, из морского анемона (Discosoma sp.) – ген, кодирующий красный флуоресцентный белок (red fluorescent protein, или RFP). Эти гены стали широко использоваться для совершенствования трансгенных технологий и в эмбриологических исследованиях. В настоящее время подобных генов известно уже около десятка.

Схема получения трансгенного организма
Здесь всё немного упрощено и идеализированно. На самом деле трансгенных рыб получали введением "крепкого" раствора клонированых молекул ДНК в эмбрион на стадии одного или двух бластомеров. Икринки с помощью пипетки переносятся в отдельную емкость и оплодотворяются. Сразу после оплодотворения в яйцеклетку с помощью очень тонкой стеклянной иглы вводят рекомбинантную ДНК. Вероятность успешного завершения операции будет выше, если инъекция произойдет в мужской пронуклеус.
(По материалам Genetic Science Learning Center)
трансгенные технологии

    Оказалось, что данио рерио как нельзя лучше подходят для экспериментов с GFP- и RFP-трансгенами и вот почему: данио рерио (Brachydanio rerio), в англоязычной литературе Zebrafish или zebra danio (рыбка-зебра), издавна использовались учеными как очень удобный модельный объект. Данио рерио крайне нетребовательны к условиям среды обитания и к кормам. Они неагрессивны и могут жить в очень небольших 4-5 литровых ёмкостях, быстро и легко размножаются и обладают почти всеми органами и анатомо-физиологическими системами организма, что есть у человека. В настоящее время хорошо изучено их эмбриональное развитие и геном. Созданы многочисленные чистые генетические линии этих рыб, строго наследующие определенные признаки. Научных статей в которых в качестве подопытных животных использовались данио рерио просто море (многие тысячи), чего только с их помощью не изучают – даже развитие кариеса зубов! В Интернете существует мощный портал (Zebrafish International Resource Center), систематизирующий научную информацию по этой рыбке. В общем, без особой натяжки можно сказать, что данио рерио – это рыбий аналог лабораторной белой мыши.
опыты с трансгенными рыбами в корпорации Тайконг Taikong Corp. - работа с трансгенными рыбами
манипуляции с икринками трансгенных рыб с помощью пипетки
трансгенная икра


Работа с трансгенными рыбами в лабораториях корпорации Тайконг – крупнейшего производителя флуоресцирующих аквариумных рыб.
Вверху – сортировка икры, слева и внизу – установки для инкубации икры и выращивания рыб с общей и локальной биофильтрацией.
Типовой модуль для работы с лабораторными рыбами
Taikong Corp. - отсадники с локальной фильтрацией
Taikong Corp. - обработка эмбрионов трансгенных рыб, триплоидизация трансгенные икринки развиваются

Развивающиеся икринки и процесс стерилизации будущих рыбок. Строго заданное время эмбрионы выдерживают при повышенной температуре.

эмбриональное развитие данио рерио

Эмбриональное развитие данио рерио. Цифры показывают время в часах от момента оплодотворения икринки. Требуется совсем небольшой срок для того, чтобы из икринки сформировался новый организм

    Применительно к рассматриваемой нами теме, данио оказались обладателями еще одной особенности: их эмбрионы быстро развиваются и долгое время остаются почти прозрачными. Да и взрослые рыбы с ослабленной пигментацией в немалой степени сохраняют это свойство. Поэтому, если организм трансгенной рыбы приобретёт способность производить флуоресцентный белок, то свечение легко будет наблюдать даже в том случае, когда экспрессия встроенного в её геном гена будет происходить в тканях, расположенных под кожей и во внутренних органах. Сходными свойствами обладает и японская рисовая рыбка – медака (Orizias latipes). Тайваньские и японские исследователи много экспериментировали с этим видом. В итоге в настоящее время мы имеем флуоресцирующих и медак, и данио.

эмбрионы трансгенных рыб под флуоресцентным микроскопом Однодневные эмбрионы GloFish (под этим названием в США продают аквариумистам трансгенных данио-рерио) под флуоресцентным микроскопом. При освещении синим светом они светятся зеленым благодаря присутствию в эпидермальных клетках GFP

Выявление GFP и RFP в трансгенных рыбках под флуоресцентным микроскопом

Одна и та же пятидневная личинка, сфотографированная при освещении белым светом (1), синим светом (2) для выявления места экспрессии GFP-гена (кожа) и зеленым светом (3) для выявления места экспрессии RFP-гена (мышцы спины). Таким образом, в геном GloFish введены сразу два трансгена. Однако взрослые рыбы выглядят просто красными, поскольку в тонком слое эпидермиса не может накопиться GFP в количестве достаточном для того, чтобы его можно было увидеть невооруженным глазом. Однако при специальном освещении и при использовании светофильтров можно обнаружить, что экспрессия GFP-гена продолжается и у взрослой генетически модифицированной рыбки. Мышцы, где идет синтез RFP, имеют значительный объем и в них накапливается много флуоресцентного белка, определяющего окраску рыбы. С возрастом цвет и флуоресценция усиливаются

    На фото, приведенных выше, видно, что одна и та же рыбка может быть носителем разных трансгенов, экспрессия которых достаточно строго локализована. Так GFP-ген в данном случае работает в клетках эпидермиса, а RFP-ген проявляет себя в мышечной ткани. Почему так происходит? Экспрессия этих трансгенов (как, впрочем, и любых других родных для организма генов) контролируется специальными последовательностями нуклеотидов в молекуле ДНК, расположенными впереди этих генов – промоторами. Именно от промотора зависит когда и при каких обстоятельствах, и в каких тканях произойдет экспрессия управляемого им гена – репортера. Поэтому при пересадке генов используют сложную конструкцию важнейшими элементами которой являются промотор (он может быть родным для того организма в геном которого вводят чужеродный ген, а может быть и чужим, взятым от какого-либо другого организма), ген-репортер (чужеродный для данного организма) и последовательность нуклеотидов, останавливающих синтез мРНК. В приведенном выше примере для GFP-трансгена был использован промотор гена цитокератина, который "допускает" экспрессию этого гена только в эпидермальных клетках. В таких случаях говорят, что промотор тканеспецифичный. Для RFP-трансгена также использован тканеспецифичный промотор гена, ответственного за синтез миозина (одного из белков мышц, который обеспечивает их сокращения), поэтому экспрессия RFP-трансгена и происходит только в мышечной ткани. Совсем не обязательно, чтобы трансгенные данио красного цвета обладали способностью к синтезу GFP. Просто Dr. Gong первоначально создавал своих рыб не для декоративных целей, поэтому они могут являться носителями сразу нескольких чужеродных генов и экспрессия некоторых из них не влияет на окраску рыбы. В дальнейшем эти рыбки были запатентованы в США компанией Yorktown Technologies LP под названием Glofish. Американцы и сейчас продолжают разводить красных рыб этой линии и их можно узнать по наличию GFP в эпидермальных клетках. Флуоресцирующие красным рыбы, производимые тайваньской фирмой Taikong Corp. – ТК-2 (Taikong-2) не обладают GFP-трансгеном. Их окраска обусловлена экспрессией всё того же RFP-трансгена, то есть в их геном введен такой же как и в случае с Glofish, ген актинии, но в сочетании с другим промотором. Тайваньские специалисты для создания своих трасгенных рыб применили промотор, контролирующий синтез актина. Актин также интенсивно синтезируется в мышечной ткани. Собственно, благодаря взаимодействию актина и миозина мышцы и обладают способностью сокращаться. В норме организм интенсивно синтезирует актин и миозин в мышечной ткани, поэтому соответствующие промоторы искусственно связанные с RFP-трансгеном отлично обеспечивают его экспрессию в мышцах.
    Профессор Гонг вводил в геном данио рерио различные конструкции. В частности, он соединял "миозиновый" промотор с GFP-геном. В этом случае GFP синтезировался в мышечной ткани и вырастали зеленые рыбы (см. фото внизу).

трансгенные данио

Трансгенные данио рерио, полученные профессором Гонгом для научных исследований

    Первоначально эти трансгенные рыбы использовались для исследований по эмбриологии. В частности, выяснялась последовательность развития в онтогенезе различных мышц.

использование генетически модифицированных рыбок в эмбриологических исследованиях

У трансгенной рыбки (в геном введена конструкция из "миозинового" промотора и GFP-трансгена) легко можно проследить ход развития мускулов головы. Hpf и dpf – это время, прошедшее с момента оплодотворения: в часах (haur past fertilyzation) и в сутках ( day past fertilyzation). Обратите внимание, эмбрионы данио, синтезирующие GFP в коже под управлением "цитокератинового промотора" (Glofish) начинают флюоресцировать раньше и выглядят иначе.
Фото из статьи проф. Гонга с соавторами "Recapitulation of Fast Skeletal Muscle Development in Zebra fish by TransgenicExpression of GFP Under the mylz2 Promoter" – DEVELOPMENTAL DYNAMICS, 227, 14-26, 2003

    В мае 2001 г. Dr. Zhiyuan Gong представил на всеобщее обозрение плоды своих исследований: сразу три цветные формы данио рерио – красную, оранжевую и зеленую (оранжевая получается при совместном синтезе GFP и RFP в мышечной ткани у "дважды трансгенных" рыб). Dr. Zhiyuan Gong начинал свою научною карьеру, работая с промысловыми видами рыб, в частности, он приложил руку и к созданию быстрорастущего лосося, о котором будет рассказано ниже. Предполагалась, что в дальнейшем лососи и форели, улучшенные с помощью методов генной инженерии, найдут народно-хозяйственное применение. Но этот путь оказался слишком тернистым. Нескончаемые дебаты вокруг того представляет или нет массовое производство этих рыб опасность для людей и окружающей среды заставили профессора прийти к выводу, что выход на рынок генетически модифицированных промысловых рыб надежно закрыт и он переключился на данио.

    Однако американская фирма Aqua Bounty полна решимости не только преодолеть все бюрократические барьеры, но добиться благосклонного отношения общественности к своему продукту – AquaAdvantage® Salmon – очень быстро растущему атлантическому лососю (Salmo salar), в геном которого "вставлены" гены другого лосося – чавычи и морской холодноводной рыбы бельдюги. Генетически модифицированные лососи растут гораздо быстрее не модифицированных рыб своего вида, что позволило бы бы снизить стоимость лососины в магазинах по крайней мере на 30%.

трансгенные лососи

Молодь атлантического лосося. Все рыбки одного возраста.
Легко узнать трансгенную

рост генетически модифицированных лососей

Сравнение скорости роста генетически модифицированных
и обыкновенных лососей. Различие впечатляет!
Рис. из статьи "Antifreeze proteins and their genes:
From basic research to business opportunity" –
CHEMTECH , 30(6), 17-28, 1999.

    Однако разрешение на реализацию трансгенных лососей населению Соединенных Штатов пока не получено. Фирма, тем не менее, содержит многотысячное поголовье этих рыб. В Интернете есть упоминания, что они идут на изготовление корма для домашних любимцев. Только ли для них? Как-то подозрительно много лососей стало продаваться в наших магазинах. Справедливости ради, стоит отметить, что в AquaAdvantage® Salmon, по-видимому действительно нет ничего опасного. Этот лосось синтезирует гормон роста другого не менее съедобного лосося – чавычи, под управлением тканеспецифичного промотра, взятого от другой съедобной рыбы – бельдюги, который обеспечивает синтез гормона роста в печени.
    В некотором смысле флюоресцирующие трансгенные аквариумные рыбки являются своеобразным индикатором того, насколько плотно теперь мы в повседневной жизни соприкасаемся с генетически модифицированными (ГМ) сельхозпродуктами и, в частности, с рыбами, а также продуктами из них. Сейчас этот индикатор ярко засиял в наших аквариумах. GloFish и ТК-1, 2, 3... – это всего лишь побочные продукты исследований по созданию трансгенных рыб. Поскольку они оказались на виду, то и разговоров вокруг них больше всего. Но кроме генетически модифицированных данио рерио, медаки, атлантического лосося разводят также ГМ карпов, ГМ форель, ГМ тиляпию, ГМ канальных сомиков, ГМ золотых рыбок. И наверняка еще кого-нибудь... Словом, трансгенные аквариумные рыбки это всего лишь вершина айсберга, большая часть которого скрыта от наших глаз.
    Интересно, что ученые на самом деле планировали сделать из флуоресцирующих рыб индикаторы. По задумке проф. Гонга они должны были начинать светиться в присутствии веществ-загрязнителей воды. Он экспериментировал с различными промоторами и генами, ответственными за синтез флуоресцентных белков, добиваясь того, чтобы эти белки начинали синтезироваться в ответ на то или иное токсическое воздействие на организм рыбы. Насколько известно, важных в практическом плане результатов получить так и не удалось.
    Аналогичные попытки использовать трансгенных светящихся данио рерио в качестве тест-организмов предпринимались сразу в нескольких лабораториях, причем даже раньше, чем об этом стал говорить Dr. Gong. В 1999 г. были, например, созданы рыбки, которые действительно начинают излучать свет в присутствии некоторых опасных загрязнителей питьевой воды, таких как полихлорированные бифенилы (это сильные канцерогены). В геном этих рыб были встроены гены светлячка связанные с промотором, который активизирует их работу тогда, когда рыбы испытывают стрессовое состояние. Разработку даже планировали внедрить в реальную практику контроля водопроводной воды в графстве Клермонт штат Цинциннати (США). Дело опять же окончилось ничем.
    Возможно сама идея подобных биотестов не совсем удачна. Для синтеза флуоресцентного белка в количестве достаточном, чтобы можно было надежно и без сложной техники зафиксировать ответ тест-организма на загрязнение, требуется немалый срок, что противоречит главному требованию к таким тестам – оперативность. А если с помощью флуоресцентного микроскопа выявлять экспрессию трансгенов, например в печени, где ответ на токсическое воздействие действительно будет быстрым, то трудоемкость этой операции и необходимость убивать тест-организм опять же сведет на нет все преимущества такого биотестирования. Это с одной стороны, а с другой – кому в нашей жизни интересно финансировать разработку чувствительных к присутствию загрязнителей в питьевой воде биотестов? Властям? Организациям, обеспечивающим водоснабжение? А вот всегда сияющие очень ярким светом аквариумные трансгенные рыбки – совсем другое дело – it is really cooool!!!

трансгенные аквариумные рыбы - данио рерио



Еще на Живой Воде о трансгенных рыбах можно прочитать:

Трансгенные аквариумные рыбки, они же генетически модифицированные, они же флюоресцирующие, Glofish, ТК-1 и TK-2 и НЕ ТОЛЬКО, теперь это обычный товар народного потребления. В этом качестве они оказались первыми среди трансгенных рыб.

От чего зависит окраска трансгенных (ТГ) аквариумных рыб? Чем освещать аквариум со "светящимися" ТГ рыбами?

Разновидности светящихся рыбок: ТК-1, TK-2, ТК-3, Glofish и другие...

Генетически модифицированная аквариумистика. Примеры "Glow-аквадизайнов".

Редакционный отдел "Живой Воды". 
24.01.2006 г.


* Ген красного флуоресцирующего белка из актинии был выделен и клонирован в России. Руководитель работ – Лукьянов Сергей Анатольевич, доктор биологических наук.
Назад к тексту


Наверх   На Главную страницу

Rambler's Top100      Рейтинг@Mail.ru     

Аквариум. Современная Аквариумистика.
Правообладатель: Живая Вода®   Любые способы полного или частичного копирования и публикации данного текста и иллюстраций без письменного разрешения администрации интернет-ресурса vitawater.ru запрещены.

   © Живая Вода, 2001-2016 гг.   @webmaster

Реклама